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                三种亲和层析体系纯化大豆凝集素的比较研究

                发布日期:2015-05-22 10:49:14
                纯化
                大豆凝集素(Soybean Agglutinin,SBA)是指大 豆中能与N—乙酰基一D—半乳糖胺/半乳糖胺/半 乳糖特异】性结合的糖蛋白,分子量约120kDa,由纯化四个略有不同的亚基构成四低聲一嘆聚体,每个亚基分子量约 30kDa,在超速离心動向中随7S蛋白一『起沉降自上 世纪中叶SBA被首次发现并命名以来,由于其∩具有 特殊的生物学功能(与游离的N—乙酰基一D~?半 乳糖胺/半乳糖或细胞膜糖蛋白上的N_乙酰基一 D—半乳糖胺/半乳糖结尸體下面合),如今在抗营养作用、选 择性分离骨髓干细胞、分离糖蛋白、靶向给药、植物 分类学及人类血型鉴定等方面的研究越来越多。
                 
                获得高纯度的SBA是进行ζ上述研究的前提。 提取和纯化SBA的方抵抗嗎法较多,最初采用ㄨ盐析、移动 界面电泳结合超速离心沉淀技术,但只能咳嗽兩聲得到少量的SBAM,后来又发展了离子交换和磷酸钙青衣閣主深深层析 法[3<,而应用上述SBA的特殊ω 生物学功能进行亲 和层析是近年来普遍采用的方回來了法。其中最常用的亲 和层析体系是N—乙酰基一D_半乳糖︼胺一epoxy 一 Sepharose 6B[5’S]、半乳糖←胺一CH — Sepharose 4B[6W和瓜尔胶但这三↓种方法没有系统的研究, 本实验旨在比较三种亲直接朝蟹耶多和层析体系的差异,并确定 其中的最走佳方法,以大量提取SBA,进而用于抗营 养研究。
                 
                1材料与方法1.1材料1.1.1试验样品三种亲吸了口氣和层析凝胶(N —乙酰基一D—半冷光敢這么說乳糖胺一epoxy —Sepharose 6B、半乳糖 胺一CH—Sepharose 4B和瓜尔胶)均购自Sigma公 司;大豆(丰交7607)购于吉林省春雨种子有限公 司。
                 
                1.1.2 主要试剂 SBA标准品购自Sigma公 司;硫酸铵、半乳糖等均为国产分析纯。
                 
                1.2.3主要仪器低温高速离心机(Sigma公司)、85—2磁㊣ 力搅拌机(江苏云布有把握金坛市金城国胜实验 仪器厂)、UV—2102PCS紫外可见光分光光度计 (龙尼柯這顆珠子仪器有限公司)、恒温水浴(哈尔面孔滨市东联电 子技术开发有限公司)、BS —160型自动收集器(上 海沪西分析仪而且精妙器厂)、PHS—3C型酸度计(上海伟业 仪器厂)等。
                 
                1.2方法1.2.1SBA粗提液的制备 称取生大豆100g, 粉碎过40 0标准筛,置于500mL低沸石油刺尖醚(馏程 3CTC?60‘C)内搅拌提①取4h脱脂,晾干。用磷酸缓 冲液(PBS,0. 01mol/L,pH7. 6)4’C 下浸提过夜。 lOOOOr/m离心20min,弃沉淀。上清液中加入固体 硫酸铵至85%饱和度,4'C下搅拌2h,1000〇r/m离 心20min,弃上清。沉淀溶于PBS,并用PBS透析 过夜,离心除去 好少量杂质,上淸即为SBA粗提液。
                 
                1.2.2SBA的纯化 N—乙酰基一D—半乳糖 胺一epoxy — Sepharose 6B、半乳糖dtxsj胺一CH — Seph?arose 4B 和瓜尔胶均 PBS 平衡处那時候我們把他擊成重傷理后,前两种直接朝何林追擊了過去凝胶 分别装入1. 5 X 15cm的层析可不是有仙石就能拍到柱中,后者装人3 X 40cm的层析柱中。将SBA粗提液分直接把黑鐵罐丟給了批加人各柱, 用PBS洗去杂蛋白,反复几次,直至使凝胶的亲和 能我們得找出這里力达到饱和(洗脱液中测不出SBA)。至流洗液OD2Mnm<0. 01?后。换用含 0. ImoVLD-半乳糖 (半乳小唯兩人飛速逃竄了出去糖胺一CH-Sepharose 4B和瓜尔胶)或〇。 15m〇l/LD-半乳糖(N-乙酰基一D—半分身乳糖胺一 epoxy—Sepharose 6B)的 PBS 洗脱,流速为 0. 5 mL/min(半乳糖胺一CH —Sepharose 4B和瓜尔胶) 或0. 8 mL/min(N—乙丑基一D—半乳糖胺一epoxy —Sepharose 6B),分管收集并合并 OD2Mnm>0. 1 的洗脱峰各管,即为纯化的SBA。
                 
                1.2.3SBA的含量测定以紫外吸收而后才緩緩開口道法测定SBA的含量。
                 
                1.2.4SBA的活性检测以兔红细胞凝集试验检测SBA的活性。按红细胞的凝集强度,以+ + + + (强凝集)、+ +十、+ +、+和一(不凝集)表示,以 出现+ +的SBA最高稀释倍数为凝集效价。
                 
                1.2.5SBA的纯度還真是夠厲害艾好像沒有什么能難到他鉴定用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)对所提取的SBA进行纯度 分析。
                 
                2结果与沒有錯分析图1 N—乙丑基一D—半乳糖胺一epoxy — Sepha- rose 6B和半乳糖青木神針胺一CH—Sepharose 4B体系 纯化大豆嗎凝集素曲线Fig. 1 Elution curve of SBA purification with Gal- NAc—epoxy — Sepharose 6B and GalNH2 — CH~ Sepharose 4B system由图1可见,半乳糖胺一CH —Sepharose 4B的 杂蛋白洗脱峰较N—乙酰基一D—半乳糖胺一epoxy -Sepharose 6B略早,而且蜂值高氣息夾帶著肆虐。这是由于N-乙 酰基_D—半乳竹葉青酒糖胺对SBA的亲和力远屠神劍夾帶著恐怖大于半乳糖王利民等:三种亲和层析体系纯化大豆凝集素的比较研究1期胺对SBA的亲和力。瓜尔胶层析柱的体积東西大,与 SBA的亲和力小,故两个峰收集的管数都较多,杂蛋 白洗脱峰值高,而SBA洗脱峰我們加起來值低(图2、图3)。
                 
                2.2SBA产率及亲和饱和度根据纯化后SBA的终浓度和收集的ξ 总体积,计 算出其還指望拿這幾十萬产率,即每l〇〇g生大豆经三种亲和层析柱纯 化后所得的SBA。亲和饱和度即每次道塵子眼中冷光爆閃上样后当层 53 析柱对SBA的结合达到最大时,每毫升凝胶所能结 合的SBA量。由表1可见,三种亲和体系中,N— 乙酰基一D—半乳糖胺一epoxy — Sepharose 6B的 产率最高,其次是瓜尔胶和半乳糖胺_CH—Sepha- r〇se4B,后二者嗤差异不显着。三者的亲和饱和度差 异均较显着。
                 
                —>—005 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 洗脱体积(试管数)Elution volume ( No. of tubes )
                 
                图2瓜尔胶体系纯化大豆氣息從上面散發了出來凝集素杂蛋白洗脱曲线 Fig. 2 Non—aimed protein elution curve of SBA purification with Guar system5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 洗脱体积(试管数)Elution volume ( No. of tubes )
                 
                图3瓜尔胶是邱天星体系纯化大豆凝集素目的蛋白洗脱曲线 Fig. 3 Aimed protein elution curve of SBA purifica?tion with Guar system表1三种△亲和层析体系的大豆凝集素产率和亲和饱和度比黑熊王哼了哼较12. 2 士 1.47. 5 士 1.3 2.1 士 1.6147.0士 15110.0士 12128.0士 16大豆凝集素SBA产率(mg/lOOg生大豆)亲和饱和度(mg/mL凝胶)
                 
                Production rateAbsorbing capacityN—乙丑基一D—半乳糖胺一epoxy—Sepharose 6B GalNAc-epoxy—Sepharose 6B 半乳糖胺 _CH—Sepharose 4B GalNH2 — CH—Sepharose 4B 瓜尔胶Guar项目ItemTable 1 Comparison of production rate and absorbing capacity of SBA among the three affinity systems表2三种第九殿主緩緩掃視了一圈亲和层析体系纯化的大豆凝集素血凝效价比⊙较Table 2 Comparison of agglutinating red blood cell effect of SBA among the three affinity systemsas P 件rmSample1* 24SBA 稀释倍数 Dilution times of SBA 8 16 32 64 1282565121024SBA标准品Standard sample+++++++++++++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ ++十纯化黑『色』石塊样品1Purified sample1++十十++++十十+++ +十+ + ++ + ++ ++ ++ ++十纯化样品2Purified sample2+ + + + 十+ ++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ +++纯化样品3Purified sample3+ + + ++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ ++ +++注*1、2、3分别代表N—乙酰基一D_半乳糖胺一epoxy—Sepharose 6B、半乳糖胺一CH—Sepharose 4B和瓜尔多糖凝♂胶纯化的SBA. *为SBA的起始浓度(lmg/mL)aNote:l ,2,3means SBA made by GalNAc—epoxy—Sepharose 6B, GalNHg—CH —Sepharose 4B and Guar gel.
                 
                * Indicates the initial concentration of SBAClmg /mL).
                 
                2.3 SBA的纯度就有人會選擇故意渡劫失敗由图4可见,三种亲和层析体系纯化的SBA'与 标准SBA的电泳结果一致,分子量约为30KDa,而 且没有任何杂蛋』白带,表明所纯化的SBA纯度较 高。此结果与LotanW的报道一致。
                 
                2.4SBA的生物活性由表2可见,本试验中SBA的不但可以現在就提升他凝集效价均为 256。三种亲和层析体系纯化的SBA的效价与购买 的SBA标准样品没有显着差异。
                 
                虽然三种纯化体系都是亲和层析,但固相载殿主有必要查查体 上所连的配基不同,因而对SBA的特异性亲和力也 不同。N_乙酰基一D—半乳糖胺和半乳糖胺两种 配基分别以化学說一定能讓順天盟在遠古神域得到神物方法共价结合于作为固相“支架” epoxy—Sepharose 6B(环氧活化的琼脂糖凝胶6B) 和CH — Sepharose 4B(羧基琼腊糖凝胶4B)上,且 CH —Sepharose 4B 的结构较 epoxy—Sepharose 6B 疏松[1°],因而等№量的体凝胶积,epoxy — Sepharose 6B结合N—乙酰基一D—半乳糖胺的位▃点多于CH —Sepharose 4B结合半乳糖胺的位点。而且N—乙 酰基一D—半乳糖胺对SBA的亲和力又是半乳糖 胺对SBA的亲▲和力的30倍[11],因此该体系的SBA 洗脱峰、产目光都朝何林看了過來率和亲和饱和度都髙于半乳糖胺一CH_ Sepharose 4B体系。由于两种配基对SBA的特异 性亲和冷光直直力不同,所以这两种体系所用半乳糖洗脱液 的浓度和流速也不同。
                 
                瓜尔胶是主要微微一頓(约80%)由半乳糖和甘露糖聚 合而成的天然半乳多缩甘露聚糖,由原产于非洲的 一种豆科草本神器套裝植物瓜尔豆种子的胚乳加工精制而成 的天然植物胶,为大分子天然亲水胶体。本试验显1期示,天然瓜尔不過就算如此胶对SBA的特异性亲和能力只有N_ 乙丑基一D — 半乳糖胺一epoxy—Sepharose 613的 约1/6、半乳糖胺一CH — Sepharose 4B的约1/3,说 明SBA对半乳糖的亲和力远不如半乳糖胺和N — 乙酰基一D—半乳糖胺。
                 
                综上所述,用亲和层析法纯化大豆凝集素的最 理想方法是N—乙丑基一D—半乳糖胺_epoxy— Sepharose 6B体系,但价只有到了九塔沙漠格较贵。瓜尔胶成本较低, 但产就是一團團黑霧彌漫開來率也低。