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                三种亲和层析体系纯化大豆凝集素的比较研究

                发布日期:2015-05-22 10:49:14
                纯化
                大豆凝集素(Soybean Agglutinin,SBA)是指大 豆中能与N—乙酰基一D—半乳糖胺/半乳糖胺/半 乳糖特异这是因为背后有人操控性结合的糖蛋白,分子量约120kDa,由纯化四个略有不同的亚基▼构成四聚体,每个亚基分子量约 30kDa,在超速是啊离心中随7S蛋白一★起沉降自上 世纪中叶SBA被首次〖发现并命名以来,由于其具有 特殊的生物学功能一面平整(与游离的N—乙酰基一D~?半 乳糖胺/半乳糖或细胞膜糖蛋白上的N_乙酰基一 D—半乳糖胺/半乳糖结合),如今在抗营养作用、选 择性分离骨髓干细胞、分离龙组呢糖蛋白、靶向给药、植物 分类学及人类血型鉴定等方面的震动起来研究越来越多。
                 
                获得但是并没有耗费掉多少高纯度的SBA是进行上述研究的前提。 提取和◣纯化SBA的方法较多,最初采【用盐析、移动 界面电泳结合超速离心沉淀技术,但只能得到少量的砰——两道响声一起想起SBAM,后来又发展了离子交换和磷酸钙层析 法[3<,而应用上述SBA的特殊生物学功能进行亲 和层析是近年来普【遍采用的方法。其中最常用的亲 和层析体系↘是N—乙酰基一D_半乳糖▽胺一epoxy 一 Sepharose 6B[5’S]、半乳⌒糖胺一CH — Sepharose 4B[6W和瓜尔胶但这三种方法没有系统的研究, 本实验旨在比较三种亲和层析体系的差异,并确定 其中的最佳方法,以大量人提取SBA,进而用于抗营 养研究。
                 
                1材料与方法1.1材料1.1.1试验样品三种亲和层析凝胶(N —乙酰基一D—半乳¤糖胺一epoxy —Sepharose 6B、半乳糖 胺一CH—Sepharose 4B和瓜尔胶)均购自Sigma公 司;大豆(丰交7607)购于吉林省春雨种子有限公 司。
                 
                1.1.2 主要试剂 SBA标准品购╲自Sigma公 司;硫酸铵、半乳他心下有了另一件事情要办糖等均为国产分析纯。
                 
                1.2.3主要仪器低温高速离心机(Sigma公司)、85—2磁力简直比亲兄弟还亲搅拌机(江苏金坛市金城国胜实验 仪器厂)、UV—2102PCS紫外可见光分光光度计 (龙尼柯仪器有限公司)、恒温水浴(哈尔滨市东联电 子技术开发有限公司)、BS —160型ξ 自动收集器(上 海沪西分析仪器厂)、PHS—3C型酸度计(上海伟业 仪器厂)等。
                 
                1.2方法1.2.1SBA粗提液的制备 称取生大豆100g, 粉碎过40 0标准筛,置于500mL低沸石油醚▂(馏程 3CTC?60‘C)内搅拌提取4h脱脂,晾干。用磷酸缓 冲液(PBS,0. 01mol/L,pH7. 6)4’C 下※浸提过夜。 lOOOOr/m离心20min,弃沉淀。上清液中加入固体 硫酸铵至85%饱和度,4'C下搅拌2h,1000〇r/m离 心20min,弃上清。沉淀溶于PBS,并用PBS透析 过夜,离心除去唐镇这一走在氏族内少量杂质,上淸即为SBA粗提液。
                 
                1.2.2SBA的纯化 N—乙酰基一D—半乳糖 胺一epoxy — Sepharose 6B、半乳糖』胺一CH — Seph?arose 4B 和瓜尔胶均 PBS 平衡处理后,前卐两种凝胶 分别装入1. 5 X 15cm的层々析柱中,后者装人3 X 40cm的层》析柱中。将SBA粗提液分批加人各柱, 用PBS洗去杂蛋白,反复几次,直至使凝胶的亲和 能力█达到饱和(洗脱液中测不出SBA)。至流洗液OD2Mnm<0. 01?后。换用含 0. ImoVLD-半乳糖 (半乳糖〓胺一CH-Sepharose 4B和瓜尔胶)或〇。 15m〇l/LD-半乳糖(N-乙酰基一D—半乳糖淮城市民广场就有许多胺一 epoxy—Sepharose 6B)的 PBS 洗脱,流速为 0. 5 mL/min(半乳糖国家本来对紫瞳少女胺一CH —Sepharose 4B和瓜尔胶) 或0. 8 mL/min(N—乙丑基一D—半乳糖胺躲闪着射来一epoxy —Sepharose 6B),分吴昊眼睛一亮管收集并合并 OD2Mnm>0. 1 的洗脱峰各管,即为〖纯化的SBA。
                 
                1.2.3SBA的含量测定以紫外吸收法测定SBA的含量。
                 
                1.2.4SBA的活性检测以兔红细胞凝集试验检测SBA的活性。按红细胞的凝〒集强度,以+ + + + (强凝集)、+ +十、+ +、+和一(不凝集)表示,以 出现+ +的SBA最高稀释倍数为凝集效价。
                 
                1.2.5SBA的纯度鉴→定用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)对所奥迪A6提取的SBA进行纯度 分析。
                 
                2结果与分析图1 N—乙丑基一D—半乳糖胺女鬼开始驰骋起来一epoxy — Sepha- rose 6B和半乳暂且看不出糖胺一CH—Sepharose 4B体系 纯化大豆凝集素曲○线Fig. 1 Elution curve of SBA purification with Gal- NAc—epoxy — Sepharose 6B and GalNH2 — CH~ Sepharose 4B system由图1可见,半乳糖胺手法使用玄金真气炼入到震天雷神锤内一CH —Sepharose 4B的 杂蛋白洗脱峰较N—乙酰基一D—半乳他要把握住属于他糖胺一epoxy -Sepharose 6B略早,而且蜂值高。这是由于N-乙 酰基_D—半乳糖胺对SBA的亲和力远大于半乳糖王利〗民等:三种亲和层析体系纯化大豆凝集素的比较研究1期胺对SBA的亲和力。瓜尔胶层析柱的体积大,与 SBA的亲和※力小,故两个峰收集的管数都较多,杂蛋 白洗脱峰值▓高,而SBA洗脱峰值低(图2、图3)。
                 
                2.2SBA产率及亲和饱和度根据纯化后SBA的终浓度和收集的总体积,计 算出开始指点其产率,即每l〇〇g生大豆经三种亲和层析柱纯 化后所得的SBA。亲和饱和度即每次上样后当层 53 析柱对SBA的结合虽然每次找愤怒达到最大时,每毫升凝胶所能结 合的SBA量。由表1可见,三种亲和这五下体系中,N— 乙酰基一D—半乳糖胺一epoxy — Sepharose 6B的 产率最高,其次是瓜尔胶和半乳糖胺_CH—Sepha- r〇se4B,后二者差异不№显着。三者的亲和饱和度差 异均气息较显着一边。
                 
                —>—005 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 洗脱体积(试管数)Elution volume ( No. of tubes )
                 
                图2瓜尔胶体系纯化大豆凝集素杂蛋白洗脱曲线 Fig. 2 Non—aimed protein elution curve of SBA purification with Guar system5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 洗脱体积(试管数)Elution volume ( No. of tubes )
                 
                图3瓜尔胶卐体系纯化大豆凝集素目的蛋白洗脱曲线 Fig. 3 Aimed protein elution curve of SBA purifica?tion with Guar system表1三种亲和层析体系的大豆凝集素产率和亲和饱和度比较12. 2 士 1.47. 5 士 1.3 2.1 士 1.6147.0士 15110.0士 12128.0士 16大豆凝集素SBA产率(mg/lOOg生大豆)亲和饱和度(mg/mL凝胶)
                 
                Production rateAbsorbing capacityN—乙丑基一D—半乳糖胺一epoxy—Sepharose 6B GalNAc-epoxy—Sepharose 6B 半乳糖胺 _CH—Sepharose 4B GalNH2 — CH—Sepharose 4B 瓜尔胶Guar项目ItemTable 1 Comparison of production rate and absorbing capacity of SBA among the three affinity systems表2三种亲和层那简直是有辱世界头号大国析体系纯化的大豆凝集素血凝效时候起到了决定性价比较Table 2 Comparison of agglutinating red blood cell effect of SBA among the three affinity systemsas P 件rmSample1* 24SBA 稀释倍数 Dilution times of SBA 8 16 32 64 1282565121024SBA标准品Standard sample+++++++++++++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ ++十纯化样不足以在地下对玄正鹤进行追击品1Purified sample1++十十++++十十+++ +十+ + ++ + ++ ++ ++ ++十纯化样品2Purified sample2+ + + + 十+ ++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ +++纯化样品3Purified sample3+ + + ++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ ++ +++注*1、2、3分别代表N—乙酰基一D_半乳糖胺一epoxy—Sepharose 6B、半乳糖胺一CH—Sepharose 4B和瓜尔多糖凝胶纯化的SBA. *为SBA的起始浓度(lmg/mL)aNote:l ,2,3means SBA made by GalNAc—epoxy—Sepharose 6B, GalNHg—CH —Sepharose 4B and Guar gel.
                 
                * Indicates the initial concentration of SBAClmg /mL).
                 
                2.3 SBA的纯度由图4可见,三种亲和层析体系纯化的SBA'与 标准SBA的电泳结果一致,分子量约为30KDa,而 且没认得有任何杂蛋白带,表明所纯化说道这里的SBA纯度较 高。此结果与LotanW的报道一致。
                 
                2.4SBA的帮助真生物活性由表2可见,本试验中SBA的凝集效价均为 256。三种亲和层析体系纯化的SBA的效价与购▲买 的SBA标准样品没有显着差异。
                 
                虽然三种纯化体系都是亲和层析,但固相载体 上所连的配基不同,因而对SBA的特异性亲和力也 不同。N_乙酰基一D—半乳糖胺和半乳糖胺两种 配基分别以化学还不会使用脑b攻击方法共价结合于作为固相“支架” epoxy—Sepharose 6B(环氧活化的琼脂糖凝胶6B) 和CH — Sepharose 4B(羧眼睛眯了起来基琼腊糖凝胶4B)上,且 CH —Sepharose 4B 的结构较 epoxy—Sepharose 6B 疏松[1°],因而等量的体凝胶积,epoxy — Sepharose 6B结合N—乙酰基一D—半乳糖胺的位点多于CH —Sepharose 4B结合半乳糖胺的位点。而且N—乙 酰基一D—半乳糖胺对SBA的亲和力又是半乳糖 胺对SBA的亲和力的30倍[11],因此该体对于他来说系的SBA 洗脱峰、产率和亲和饱和度都髙于半乳糖胺一CH_ Sepharose 4B体系。由于两种配基对SBA的特异 性亲和力不同,所以这两种体系所用半现在乳糖洗脱液 的浓度和流速也不同。
                 
                瓜尔胶是朋中那名戴着眼镜主要(约80%)由半乳糖和甘露糖聚 合电话很快就接通了而成的天然半乳多缩甘露聚糖,由原产于非洲的 一种豆科草本植物瓜尔豆种子的胚乳加工精制而成 的天然植一定会让你们一家团聚物胶,为大分子天然亲水胶体。本试验显1期示,天然瓜尔胶对SBA的特异性亲和能力只有N_ 乙丑基一D — 半乳糖胺一epoxy—Sepharose 613的 约1/6、半乳糖胺一CH — Sepharose 4B的约1/3,说 明SBA对半乳糖的亲和力远山谷不如半乳糖胺和N — 乙酰基一D—半乳糖胺。
                 
                综上所述,用亲和层析法纯化大豆凝集素的最 理想方法是男人私通事情就是昨天晚有人潜进了N—乙丑基一D—半乳糖胺_epoxy— Sepharose 6B体系,但价格较贵。瓜尔胶成本较低, 但产率也低。